刘文、王洪波、陶疆等：细菌细胞色素P450酶催化吡咯吲哚霉素生物合成过程中的多步氧化反应

Concise Report

A Bacterial Cytochrome P450 Enzyme Catalyzes Multistep Oxidation Reactions in Pyrroindomycin Biosynthesis

Jiabao Wang, Yu Xu, Dandan Chen, Jiang Tao,* Hongbo Wang,* and Wen Liu*

Cytochrome P450 enzymes (P450s) belong to a large family of oxidative hemeproteins and catalyze highly diverse oxygenation reactions that are involved in the biosynthesis of various natural products. Here, we report a multifunctional cytochrome P450 enzyme, PyrE2, which catalyzes the regioselective, successive 6-electron oxidation of an inert methyl group to produce a carboxyl product through formation of the hydroxyl and aldehyde intermediates in pyrroindomycin biosynthesis. The time-course biotransformation was characterized by the presence of the hydroxyl and aldehyde intermediates, the lag of the formation of the carboxyl product, and the subsequent loss of both intermediates, indicating that each 2-electron oxidation exhibits the distributive mechanism that requires substrate binding and product releasing. Bioinformatics analysis shows that the homologs of pyrE2 are common in the gene clusters of the spirotetronates varying in the oxidative state of the corresponding exocyclic carbon, indicating the generality and diversity of P450-catalyzed oxygenation in related biosynthetic pathways.

Cytochrome P450 enzyme | Pyrroindomycin | Multistep oxidation reactions | Enzyme catalysis | Selectivity

细菌细胞色素P450酶催化吡咯吲哚霉素生物合成过程中的多步氧化反应

为了应对当下抗生素大量使用带来的抗性问题，开发新型抗生素成为了迫切的需求。中国科学院大学上海有机化学研究所刘文团队对吡咯吲哚霉素生物合成途径展开了系统性研究（J Am Chem Soc 2012, 134, 17342. Nat Chem Biol2015, 11, 259. Org Biomol Chem 2016,15 , 88. Nat Chem 2023,15, 177.）

吡咯吲哚霉素（PYRs）是自然界中发现的第一例螺环乙酰乙酸内酰胺类化合物，对耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌和耐万古霉素的粪肠球菌表现出强大的抗菌活性。构效关系研究表明，其良好的生物活性与独特的环系骨架密不可分，螺环上甲基的氧化态对于PYRs抗菌活性有着重要的影响。目前我们较为熟知的螺环乙酰乙酸内酯（内酰胺）类天然产物中，LOBs的甲基氧化后修饰途径已经得到了研究（Chinese J Chem 2023, 41,1478.）。研究PYRs[6, 5]螺环上C20位甲基的氧化修饰有利于加深我们对螺环乙酰乙酸内酯类/内酰胺类天然产物生物合成机制的理解。

最近，刘文、王洪波和陶疆等通过生物信息学分析，体内基因敲除和体外生化等实验揭示了PYR生物合成途径中P450酶PyrE2的功能。体外生化实验表明PyrE2可以催化[6, 5]螺环C20位甲基的三步连续氧化反应来修饰五环骨架。时间梯度实验发现了中间体5和6的积累、化合物4生成的滞后性以及中间体5和6的减少，这些证据共同表明PyrE2催化化合物3的过程是解离性的。这项工作表征了甲基化合物3和羧化产物4之间未知的酶促生物转化过程，并进一步扩大了我们对PYRs生物合成的了解。

图1. 体外表征PyrE2催化反应和每个氧化步骤的相对速率。(A) 由PyrE2进行的三个顺序氧化的示意图; (B) 通过HPLC分析3的酶促转化: (i) 底物4; (ii) 底物3; (iii）3与PyrE2孵育30 min和(iv) 3与PyrE2孵育2 h; (C) PyrE2进行的240 min时间梯度实验，底物3(黑色方块)，羟基中间体5(红色球体)，醛基中间体6(蓝色正三角)和羧酸产物4(绿色倒三角)。

上述研究结果作为Report发表于Chin. J. Chem. 2023, 41, 2439—2445. DOI: 10.1002/cjoc.202300178。该项工作得到了国家重点研发计划，国家自然科学基金、上海地方高校高水平创新研究团队的资助。

认识本文的作者们

Left to Right: Jiabao Wang, Yu Xu, Dandan Chen, Jiang Tao, Hongbo Wang, and Wen Liu

刘文研究员简介

中国科学院大学 上海有机化学研究

刘文，中国科学院上海有机化学研究所副所长，研究员，博士生导师。2000年于中国协和医科大学（中国医学科学院）获得博士学位（美国加州大学戴维斯分校化学系联合培养）。2000年9月—2001年8月，于美国加州大学戴维斯分校化学系（Department of Chemistry, University of California-Davis）进行博士后工作；2001年9月—2003年8月，就职于美国威斯康星大学麦迪逊分校药学院（School of Pharmacy, University of Wisconsin-Madison），研究助理。2003年8月至今，任职于中国科学院上海有机化学研究所，研究员；2019年至今，任中国科学院上海有机化学研究所副所长。国家自然科学基金委2005年度“杰出青年基金”获得者；上海市科学技术委员会2005年度“启明星计划”和“浦江人才计划”入选者；在Nature、Nature Chemical Biology、Nature Communications、Natural Product Reports、Accounts of Chemical Research、Journal of the American Chemical Society、Angewandte Chemie International Edition、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 等期刊发表了多篇研究论文。